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制作石蜡切片的步骤与方法

2024-11-29 18:19:10

怎样制作石蜡切片

制作石蜡切片的步骤与方法 1

石蜡切片是生物学、医学等领域常用的一种制片技术,用于观察和研究组织细胞的形态结构。本文将详细介绍石蜡切片的制作过程,包括取材与固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、切片与染色、封固等关键步骤,帮助读者全面了解并掌握这一技术。

制作石蜡切片的步骤与方法 2

一、取材与固定

1. 取材

制作石蜡切片的步骤与方法 3

取材是制作石蜡切片的第一步,需要迅速且准确地从生物体中切取所需组织。取材时应明确组织的来源及部位,确定纵切还是横切,并确保材料体积适中,以便于后续处理。常用的固定液为FAA(万用固定液),其配方为50%或70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml。柔软材料用50%酒精配制,坚硬材料用70%酒精配制。

2. 固定

将切取的组织立即浸入固定液中,目的是使其尽可能保持活体时的结构状态。固定时间根据材料类型和实验需求而定,短则数小时,长则数月或数年。固定后,组织应充分水洗,以去除固定液及其结晶沉淀,避免影响后续染色效果。若暂时不能进行下一步操作,可将组织保存在70%酒精溶液或FAA固定液中,置于冰箱中4℃保存。

二、脱水与透明

1. 脱水

脱水是将组织中的水分逐步替换为酒精的过程,以便后续透明和浸蜡。脱水通常使用梯度酒精,从低浓度到高浓度逐步进行,如70%、85%、95%、100%酒精,每步1-2小时。脱水过程中要保证脱水梯度和每一步脱水时间,确保水分完全脱净,但也不能过度脱水,以免组织变脆、收缩。

2. 透明

透明是将组织中的酒精替换为透明剂(如二甲苯)的过程,使光线能够透过组织,便于观察。透明通常使用二甲苯与酒精的等体积混合液,再逐步过渡到纯二甲苯,每步1小时。透明过程中要随时盖紧盖子,防止空气中的水分进入和透明剂的挥发。

三、浸蜡与包埋

1. 浸蜡

浸蜡是将透明后的组织浸入溶化的石蜡中,使石蜡渗透到组织内部,起到支持和保护的作用。浸蜡前,需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液(如二甲苯与酒精的等体积混合液)替换出组织内的酒精。浸蜡通常使用低温浸蜡法,即在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加入碎蜡至过饱和,过夜12-24小时。然后倒出二甲苯与石蜡的混合液,加入纯石蜡,共5-24小时,纯石蜡需要更换三次。

2. 包埋

包埋是将浸蜡后的组织块用石蜡包埋起来,形成蜡块,便于切片。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素,选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52-56℃,植物材料用的石蜡熔点为54-58℃。包埋时,用镊子夹取石蜡模子在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,倒入少许石蜡,再将组织块放入蜡模中,排列整齐,再倒入熔蜡。包埋动作要迅速,以免熔蜡凝固。

四、切片与染色

1. 切片

切片是将包埋好的蜡块用切片机切成薄片的过程。切片前,需将蜡块修成规整的梯形或粘在包埋框上,上机切片。切片的厚度通常在8-20μm范围内,具体根据实验要求确定。切片时,右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min为宜。切成的蜡带用毛笔轻轻挑起,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

2. 染色

染色是将切片中的不同结构染成不同的颜色,以便于观察。最常用的染色方法是苏木精-伊红染色法(HE染色法)。染色前,需将切片脱蜡、复水。染色过程包括苏木精染色、盐酸乙醇分化、伊红染色等步骤。苏木精染色使细胞核呈蓝紫色,伊红染色使细胞质呈粉红色。染色时间根据染色液的成熟程度、室温高低及实验室的实际情况灵活掌握。染色后,切片需经过梯度酒精脱水、二甲苯透明,最后封固。

五、封固

封固是将染色后的切片用中性树胶封固在载玻片上,以便于保存和观察。封固前,需在切片上滴加适量中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,避免产生气泡。封固后的切片放入42℃温箱中干燥过夜,然后贴上标签,保存备用。

注意事项

1. 取材:取材动作要迅速,避免组织细胞的成分、结构等发生变化。切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

2. 固定:固定液应以新配为好,配好后贮存在阴凉处,避免日光照射引起化学变化。固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20-30倍,水分多的材料中间应更换1-2次新液。

3. 脱水:脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分和酒精挥发。在低浓度酒精中停留时间不宜过长,以免组织变软;在高浓度或纯酒精中停留时间也不宜过长,以免组织变脆。

4. 透明:更换每级透明剂时,动作要迅速,避免材料干涸和吸收湿气。如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水。

5. 浸蜡:浸蜡过程应尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度。透蜡温度要恒定,操作要迅速,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

6. 染色:染色过程中要严格控制染色时间,避免染色过深或过浅。染色后需经过充分的冲洗和分化,以获得清晰的染色效果。

7. 封固:封固前要确保切片干燥,避免产生气泡。封固后的切片应妥善保存,避免受潮和损坏。

通过以上步骤和注意事项的详细介绍,相信读者已经对石蜡切片的制作过程有了全面的了解。在实际操作中,应根据实验需求和材料特性灵活调整步骤和参数,以获得最佳的制片效果。

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